 抗体に基づくアレイを用いた乳癌療法のための薬物選択
专利摘要:
本発明は、腫瘍細胞中のシグナル伝達経路の成分の活性化状態を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の使用に由来するシグナル伝達経路の成分の活性化状態に関する情報は、癌の診断、予後診断、および癌治療の設計において使用できる。 公开号:JP2011514522A 申请号:JP2010547852 申请日:2009-02-24 公开日:2011-05-06 发明作者:フィリップ キム；シャラット シン；ブルース ネリ；ジャンヌ ハーヴェイ；ロバート バーラム；シンジュン リュウ；リミン リュウ 申请人:プロメテウス ラボラトリーズ インコーポレイテッド； IPC主号:G01N33-574
专利说明:
[0001] 本出願は、２００８年２月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／０３１，３１９号明細書、２００８年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／１０６，４０４号明細書、２００８年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／１０８，３８４号明細書、２００８年１１月２５日に出願された米国特許仮出願第６１／１１７，９０８号明細書、および２００８年１２月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／１４０，５５８号明細書に対する優先権を主張する２００９年２月２４日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３５０１３号明細書の継続出願であり、前記特許は、あらゆる目的のために全体が参照により本明細書に組み込まれる。] 技術分野 [0002] 細胞内のシグナル伝達のプロセスは、少数の例を挙げると細胞の分裂および死、代謝、免疫細胞活性化、神経伝達、ならびに感覚的知覚を含む様々な生物学的機能に関与している。したがって、細胞内の正常シグナル伝達の混乱は、糖尿病、心疾患、自己免疫、および癌などの多数の疾患状態を引き起こす可能性がある。] 背景技術 [0003] １つの明確に特徴付けられたシグナル伝達経路は、細胞内における上皮成長因子（ＥＧＦ）から細胞増殖促進へシグナルを伝達することに関与するＭＡＰキナーゼ経路である（図１参照）。ＥＧＦは、ＥＧＦの結合によって活性化される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である膜貫通受容体結合チロシンキナーゼに結合する。ＥＧＦのＥＧＦＲへの結合は、受容体の細胞質ドメインであるチロシンキナーゼ活性を活性化する。このキナーゼ活性化の１つの結果は、チロシン残基上でのＥＧＦＲの自己リン酸化である。活性化されたＥＧＦＲ上のリン酸化チロシン残基は、例えばＧＲＢ２などのアダプタータンパク質を含有するＳＨ２ドメインの結合のためのドッキング部位を提供する。アダプターとしてのその機能において、ＧＲＢ２は、ＧＲＢ２上のＳＨ３ドメインによって、グアニンヌクレオチド交換因子であるＳＯＳへさらに結合する。複合体ＥＧＦＲ−ＧＲＢ２−ＳＯＳの形成は、ＲａｓからのＧＤＰの除去を促進するグアニンヌクレオチド交換因子のＳＯＳ活性化をもたらす。ＧＤＰが除去されると、ＲａｓはＧＴＰに結合し、活性化されるようになる。] 図１ [0004] 活性化後、Ｒａｓは、セリン／トレオニン特異的プロテインキナーゼであるＲＡＦキナーゼに結合して、そのプロテインキナーゼ活性を活性化する。その後には、細胞増殖を導くプロテインキナーゼカスケードの活性化が続く。概略を述べると、ＲＡＦキナーゼは次に、また別のセリン／トレオニンキナーゼであるＭＥＫをリン酸化して活性化する。活性化されたＭＥＫは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化して活性化する。特にＭＡＰＫによるまた別のリン酸化の標的は、４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ＲＳＫ）である。ＭＡＰＫによるＲＳＫのリン酸化は、ＲＳＫの活性化を生じさせ、これは順にリボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化する。ＭＡＰＫのまた別の公知の標的は、様々な癌において変異している細胞増殖のために重要な遺伝子である癌原遺伝子ｃ−Ｍｙｃである。ＭＡＰＫはさらに、また別のプロテインキナーゼであるＭＮＫもリン酸化して活性化するが、これは順に転写因子であるＣＲＥＢをリン酸化する。間接的には、ＭＡＰＫはさらに細胞増殖に関係しているまた別の転写因子をコードするＦｏｓ遺伝子の転写も調節する。そのような転写因子のレベルおよび活性を変化させることによって、ＭＡＰＫは、ＥＧＦから細胞周期の進行のために重要である遺伝子の変化した転写へオリジナルの細胞外シグナルを伝達する。] [0005] シグナル伝達経路が細胞増殖において中心的な役割を果たすことを前提にすると、多数の癌が細胞増殖経路の異常な活性化を生じさせるシグナル伝達成分における突然変異およびその他の変化の結果として発生することは驚くには当たらない。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現もしくは活動過剰は、多発性膠芽腫、大腸癌および肺癌を含む多数の癌と関連付けられてきた。これは肺癌のためのゲフィチニブおよびエルロチニブ、ならびに大腸癌のためのセツキシマブを含む、ＥＧＦＲに向けられた抗癌療法薬の開発を促進してきた。] [0006] セツキシマブは、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合ドメインに結合するモノクローナル抗体阻害剤の一例であり、そこでＥＧＦＲチロシンキナーゼを活性化するリガンドの結合を妨害する。これとは対照的に、ゲフィチニブおよびエルロチニブは、細胞内に局在するＥＧＦＲチロシンキナーゼを阻害する低分子である。キナーゼ活性の非存在下では、ＥＧＦＲは、ＧＲＢ２などの下流アダプタータンパク質に結合するための前提条件である、チロシン残基での自己リン酸化を受けることができない。成長のためにこの経路に依存する細胞内のシグナル伝達カスケードを停止させることによって、腫瘍の増殖および移動が減少させられる。] [0007] さらに、他の試験は、ヒト黒色腫の約７０％およびこれより低い割合の他の腫瘍が、ＭＡＰＫ経路の持続性活性化をもたらすＲａｆ遺伝子における点変異（Ｖ５９９Ｅ）を有することを証明している（例えば、Ｄａｖｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，４１７：９４９−９５４（２００２）を参照されたい）。そのような結果は、特にシグナル伝達経路における突然変異は特定のタイプの腫瘍の特性である可能性がある、そしてそのような特異的な、変化したシグナル伝達経路は、化学療法薬によるインターベンションにとって前途有望な標的であることを示唆している。] 発明が解決しようとする課題 [0008] 様々な癌治療、特別には癌化学療法が、細胞増殖または細胞死の各々に関係する細胞シグナル伝達経路を遮断または活性化するいずれかによって直接的または間接的いずれかで機能できることを前提に、癌の特定形態における所定のシグナル伝達経路の活性は、様々な癌治療の有効性についての優れたインジケータとして機能できる可能性がある。したがって、その他の必要を満たすことに加えて、本発明は、個別患者にとって有望な抗癌療法の有効性を評価するための方法を提供する。したがって本発明は、医師が各患者のために適切な用量および適切な時点で適合する癌療法を選択することを支援するための方法を提供する。] 課題を解決するための手段 [0009] 本発明は、腫瘍細胞（例えば、乳房腫瘍の循環細胞）中のシグナル伝達経路の成分の活性化状態を検出するための組成物および方法を提供する。本発明の実施から引き出されるシグナル伝達経路の成分の活性化状態に関する情報は、癌の診断、予後診断、および癌治療の設計において使用できる。] [0010] １つの態様では、本発明は、乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記抗癌剤が、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法を提供する。] [0011] 好ましい実施形態では、乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療のために適切であることを指示する工程と、を含む。] [0012] 一部の実施形態では、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療のために適切な抗癌剤の選択を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療のために適切な抗癌剤の選択を改善するために有用な可能性がある。] [0013] また別の態様では、本発明は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法を提供する。] [0014] 好ましい実施形態では、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性であることを指示する工程と、を含む。] [0015] 一部の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答の同定を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答の同定を改良するために有用な可能性がある。] [0016] さらにまた別の態様では、本発明は、乳房腫瘍を有する被験者の抗癌剤を用いた治療への応答を予測するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法を提供する。] [0017] 好ましい実施形態では、乳房腫瘍を有する被験者の抗癌剤を用いた治療への応答を予測するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性が高いことを指示する工程と、を含む。] [0018] 一部の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療へ被験者が応答する見込みの予測を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療へ被験者が応答する見込みの予測を改良するために有用な可能性がある。] [0019] また別の態様では、本発明は、固体支持体上に固定された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、各希釈系列中の捕捉抗体は細胞抽出物中のシグナル伝達経路の成分または他のタンパク質（例えば、核ホルモン受容体）の成分に対応する１つ以上の分析物に対して特異的であるアレイを提供する。本明細書に記載したアドレス可能なアレイは、乳癌に関係するシグナル伝達分子および他のタンパク質の発現および／または活性化状態を決定するために特に有用である。] [0020] 追加の態様では、本発明は、切断受容体（truncated receptor）の存在（または非存在）を検出するための方法であって： （ａ）細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と； （ｂ）前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と； （ｃ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を前記対応する切断受容体に対して特異的である検出抗体とインキュベートする工程と； （ｅ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする工程と； （ｆ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。] [0021] 関連態様では、本発明は、切断受容体の存在（または非存在）を検出するための方法であって： （ａ）細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と； （ｂ）前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と； （ｃ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を、前記対応する切断受容体に対して特異的である複数の活性化状態非依存性抗体および複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、 前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーへチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、 （ｅ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする工程と； （ｆ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。] [0022] 本発明のその他の目的、特徴、および利点は、当業者には以下の詳細な説明および図面から明白になるであろう。] 図面の簡単な説明 [0023] 本発明の実施において使用できる細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の１つの実施例を示す図である。マイトジェンシグナルを細胞増殖に変換させるために細胞によって使用されるＥＧＦＲ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の成分が描出されている。] [0024] 本明細書で記載した近接アッセイが単細胞感受性を備えるリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）およびリン酸化ＨＥＲ−２（ｐＨＥＲ−２）を検出した、本発明の１つの実施形態を示す図である。] [0025] 本明細書に記載した近接アッセイがＨＥＲ−２を発現する細胞中でのみ単細胞レベルでのＨＥＲ−２の検出のための高度に特異的なアッセイを生じさせたことを示す図である。] [0026] 癌治療の全経過を通して薬物選択のための本発明のアドレス可能なアレイの適用を略図によって示す図である。] [0027] 例えばＥＧＦＲ／ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路におけるような、受容体チロシンキナーゼ経路の成分への抗体の希釈液を含むアドレス可能なアレイの実施例を略図によって示す図である。抗体は、アドレス可能なアレイ上の４種の希釈液中で３回ずつプレーティングされる。] [0028] 腫瘍血管新生において活性化されたシグナル伝達経路の成分への抗体の希釈液を含むアドレス可能なアレイの実施例を略図によって示す図である。抗体は、アドレス可能なアレイ上の４種の希釈液中で３回ずつプレーティングされる。] [0029] 腫瘍血管新生において活性化されたシグナル伝達経路の成分への抗体の希釈液を含むまた別のアドレス可能なアレイの実施例を略図によって示す図である。抗体は、アドレス可能なアレイ上の４種の希釈液中で３回ずつプレーティングされる。] [0030] 腫瘍血管新生において活性化された受容体チロシンキナーゼ経路およびシグナル伝達経路の成分への抗体の希釈液を含むアドレス可能なアレイの実施例を略図によって示す図である。抗体は、アドレス可能なアレイ上の４種の希釈液中で３回ずつプレーティングされる。] [0031] 腫瘍血管新生において活性化された受容体チロシンキナーゼ経路およびシグナル伝達経路の成分への抗体の希釈液を含むまた別のアドレス可能なアレイの実施例を略図によって示す図である。抗体は、アドレス可能なアレイ上の希釈系列中で３回ずつプレーティングすることができる。] [0032] ５例の乳癌および６例の正常サンプルについてのＥＧＦＲの相対リン酸化レベルを示す図である。データは、表４０にも示した。] [0033] ５例の乳癌および６例の正常サンプルについてのＨＥＲ−２の相対リン酸化レベルを示す図である。データは、表４１にも示した。] [0034] ５例の乳癌患者についてのＶｅｒｉｄｅｘ ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商品名）システム上でのＣＴＣ染色の画像を示す図である。細胞系コントロールは、Ａ４３１（ＥＧＦＲについて陽性）およびＳＫＢｒ３（ＨＥＲ−２について陽性）である。] [0035] 全長ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）は、ポリスチレンビーズもしくはポリマーデキストランに付着させたＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに結合する抗体を用いて患者サンプルから取り除けることを示す図である。] [0036] 例えばｐ９５ＥｒｂＢ２などの切断受容体を検出するための本発明の１つの実施形態を示す図である。ＳＡ＝ストレプトアビジン；ＨＲＰ＝西洋ワサビペルオキシダーゼ；ＴＳＡ＝チラミドシグナル増幅。] [0037] ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に向けられた抗体でコーティングされたビーズを用いた前処理が、ＥｒｂＢ２細胞内ドメイン（ＩＣＤ）シグナルに影響を及ぼすことなく全長ＥｒｂＢ２シグナルをほぼ完全に除去したことを示す図である。] [0038] ＡＰＭＡ（（４−アミノフェニル）酢酸第二水銀）処理は、ＢＴ−４７４細胞内でのｐ９５ＥｒｂＢ２リン酸化を増加させたことを示す図である。] [0039] ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）がＴ４７Ｄ細胞内でのｐ９５ＥｒｂＢ２リン酸化を増加させたことを示す図である。] [0040] 特定患者のために適切な乳癌療法を選択することに関して本発明の方法を臨床実践に影響を及ぼすために使用できる複数の時点を示す図である。] [0041] 結合した各標的タンパク質毎のその後のチャネリング事象のためには酵素と連結した２つの追加の検出抗体の共局在化に依存する、本発明のアッセイフォーマットの１つの実施形態を示す図である。] [0042] ｐＨＥＲ−１およびｐＨＥＲ−２アッセイに対する単細胞感受性を示す図である。] [0043] 様々な細胞系におけるＥＧＦまたはＨＲＧβ処理を用いたＥｒｂＢ発現／活性化を示す図である。] [0044] ＥＧＦまたはＨＲＧβ刺激を用いたＴ４７Ｄ ＥｒｂＢＲＴＫプロファイルを示す図である。] [0045] ＥｒｂＢ経路アレイの典型的な実施形態を示す図である。] [0046] Ｉ．はじめに 上述したように、細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の活性化および細胞死に関係する経路の非活性化は、多数の異なるタイプの癌を特性付ける分子的特徴の非限定的な例である。多数の場合において、特定のシグナル伝達経路の活性、およびそれらの成分は、所定タイプの癌のための分子シグニチャーとして機能することができる。そのような活性化された成分は、治療介入のために有用な標的をさらに提供することができる。したがって、治療前、治療中、および治療後に癌細胞内での特定シグナル伝達系の活性レベルに関する知識は、採用するべき適切な治療経過を選択するために使用できる高度に重要な情報を医師に提供する。さらに、癌細胞内で治療が進行するにつれて活性になるシグナル伝達経路の持続的監視は、例えば、同一もしくはまた別のシグナル伝達経路のいずれかを活性化するまた別の異常を通して癌細胞が治療に耐性になった場合は、医師に特定の治療コースを持続するか、または別の治療ラインへ切り替えるかを促すように、医師に治療の有効性に関する追加の情報を提供することができる。] [0047] したがって、本発明は、特異的多重高スループットアッセイにおいて固形腫瘍の希少循環細胞などの腫瘍組織または腫瘍外細胞中での複数の無秩序のシグナル伝達分子の発現および活性化状態を検出するための方法および組成物を提供する。本発明は、無秩序なシグナル伝達経路をダウンレギュレートまたは活動停止させるために適切な療法（単剤または薬物の組み合わせ）を選択するための方法および組成物もさらに提供する。そこで、本発明を使用すると、癌患者に合わせた個別の療法の設計を促進することができる。] [0048] 単細胞のレベルでのシグナル伝達経路の活性の決定を通しての循環中で腫瘍細胞を検出および同定する能力は、本発明の重要な利点である。腫瘍細胞は、「微小転移」（播種性腫瘍細胞）としての様々な初期段階の癌を備える患者の血液中で見いだされることが多く、転移性癌においても見いだされる。血液中の腫瘍細胞の数は、腫瘍の病期およびタイプに依存するであろう。生検標本は典型的には原発腫瘍上で入手され、ほとんどの転移腫瘍では生検が行われないので、そのような腫瘍サンプルについて分子分析を行うことが極めて困難である。腫瘍転移中には、大多数の進行性腫瘍細胞は原発腫瘍を離れ、血液系およびリンパ系を通って移動し、遠隔部位に達する。そこで、血液由来の循環腫瘍細胞は、腫瘍細胞の最も進行性で均質な集団を表す。しかし、血液中の転移腫瘍細胞の数は、極めて少ないことが多く、血液１ｍＬ当たり１個〜数千個まで様々である。そのような希少細胞中でシグナル伝達経路を単離してアッセイし、この情報をより効果的な癌治療に向けて適用する能力は、本発明の１つの目的である。] [0049] 一部の実施形態では、本発明の多重高スループットイムノアッセイは、固形腫瘍の循環細胞内における１つ以上のシグナル伝達分子の単細胞レベルでの活性化状態を検出することができる。実際に、ＥＧＦＲなどのシグナル伝達分子は、約１００ゼプトモルの感受性ならびに約１００ゼプトモル〜約１００フェムトモルの線形ダイナミックレンジで検出することができる。そこで、希少循環細胞中の複数シグナル伝達物質の活性化状態の単細胞検出は、癌の予後診断および診断ならびに個別の標的療法の設計を促進する。] [0050] 希少循環細胞には、固形腫瘍から転移または微小転移している固形腫瘍の循環細胞が含まれる。循環腫瘍細胞、癌幹細胞、および、例えば循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環前血管新生骨髄性細胞、および循環樹状細胞などの腫瘍へ移動している（例えば、化学走化性に起因する）細胞は、固形腫瘍と関連している循環細胞の一部の例である。] [0051] 当該のシグナル伝達分子は、典型的にはそれらのインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）活性化状態を維持するために循環細胞が単離された直後に、好ましくは約２４、６、もしくは１時間以内、およびより好ましくは約３０、１５、もしくは５分間以内に抽出される。単離した細胞は、さらにまた通常はナノモル〜ミクロモル濃度の１つ以上の成長因子とともに、シグナル伝達分子の活性化を復活させる、または刺激するために約１〜３０分間にわたりインキュベートすることができる（例えば、Ｉｒｉｓｈら、Ｃｅｌｌ，１１８：２１７−２２８（２００４）を参照されたい）。] [0052] 以下でより詳細に説明するように、個別患者のために見込みのある抗癌療法を評価するために、単離した細胞は様々な用量で１つ以上の抗癌剤とインキュベートすることができる。成長因子の刺激は、次に数分間（例えば、約１〜５分間）または数時間（例えば、約１〜６時間）にわたり実施することができる。抗癌剤を用いた、および用いないシグナル伝達経路の示差的活性化は、各個別患者のために適正用量での適切な癌療法の選択において役立つことができる。循環細胞は、さらにまた抗癌剤治療中の患者サンプルから単離し、療法の変更を実施すべきかどうかを決定するために１つ以上の成長因子を用いて刺激することもできる。したがって、本発明の方法は、有利にも、医師が各患者のために正しい時点に正しい用量で適正な抗癌剤を提供することを支援する。] [0053] 乳癌に関連して、現行の試験選択肢は不十分であるが、それは乳癌患者における原発腫瘍および転移腫瘍療法の治療が、疾患の初期段階に採取された生検サンプルからの１回限りの診断に基づいているからである。詳細には、乳癌の初期および転移期の両方についての治療介入は、転移癌患者からの生検サンプル入手が実行不可能であるために、疾患の初期段階に採取された生検サンプルからの初期診断のみに基づいている。しかし乳房腫瘍は、時間および治療の関数として進化するので、乳房腫瘍の時間的監視は乳癌患者の最適な管理のために極めて重要である。例えば、受容体チロシンキナーゼのＥｒｂＢ（ＨＥＲ）ファミリーの１つ以上の活性化状態における変化は、再発時の治療選択に影響を及ぼす可能性がある。実際に、原発癌と転移癌との間のＨＥＲ−２状態における不一致は、全乳癌患者の３７％までがＨＥＲ−２陰性原発腫瘍からＨＥＲ−２陽性転移癌へ変化するために、一般的である。さらに、患者はＨＥＲ−１／２活性化に起因してホルモン療法に対する新規耐性を有する、または獲得耐性を発生する場合がある。一部の場合には、患者は、ｐ９５ＨＥＲ−２を発現する腫瘍細胞の存在に起因してＥｒｂＢ標的療法への新規耐性を有する、または獲得耐性を発生する可能性がある。結果として、現行技術には感受性および特異性が欠けており、療法下の患者を監視するためには使用できない、そして個別治療決定を誘導するために経路プロファイリングを利用しないので、医師が適切な時点に適切な癌療法を処方することを支援するアッセイに対する満たされていない臨床的必要が存在する。] [0054] 現在利用できる乳癌検査の選択肢とは対照的に、本発明の方法は、例えば血液および／または細針吸引液（ＦＮＡ）由来の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）などのサンプルを使用して固形乳房腫瘍の「リアルタイム生検」を提供することによって、疾患の全病期を通して乳癌患者を監視することを可能にする。非限定的実施例として、本明細書に記載した乳癌アッセイは、疾患の初期段階に患者における乳癌の初期診断に使用することができる。適切な癌療法の選択は、本明細書に記載した単一検出および近接二重検出アッセイを使用して、抗癌剤を用いて、および用いずに特異的シグナル伝達経路の活性化状態をプロファイリングすることによって誘導される。有利にも、本発明の方法は、疾患の任意の段階に採取され、単一検出および近接二重検出アッセイを使用して分析されるサンプルに基づいて治療的介入を行うことができるので、疾患の進行または退行を監視するためにも使用できる。したがって、乳癌の初期および転移期のために適切な癌療法の選択は、リアルタイム診断および特異的シグナル伝達経路分子の活性化状態の分析によって誘導される。] [0055] 本発明の方法は、有利にも癌管理における重要な問題に対応し、乳癌患者のためにより高度の標準看護を提供できるように適合させられるが、それは前記方法が（１）増加した感受性を提供する（例えば、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ−２などの全およびリン酸化シグナル伝達分子を検出するために単細胞検出を達成できる）、（２）増加した特異性を提供する（例えば、３抗体近接アッセイはリン酸化シグナル伝達分子を検出するための特異性を増強する）、（３）経路プロファイリングを可能にする（例えば、特異的シグナル伝達分子の活性化状態は患者由来のＣＴＣおよびＦＮＡ中で検出できる）、および（４）患者サンプルを入手することに伴うあらゆる問題を排除する（例えば、アッセイはほんの少数の腫瘍細胞上で実施できる）からである。本明細書に記載した新規アッセイではあらゆるサンプルを使用できるが、ＣＴＣは最も進行性の腫瘍細胞を表し、各腫瘍はＣＴＣを遊離させることが公知であり、遺残腫瘍もしくは接近するのが困難な転移腫瘍の唯一の起源である可能性があり、そしては血中で見いだされるので、特に有用である。したがって本発明の方法は、乳房腫瘍組織の連続サンプリングを可能にし、時間および療法の関数として腫瘍細胞内で発生する変化に関する貴重な情報を生じさせ、そして迅速に発生する癌経路シグニチャーを監視するための手段を医師に提供する。] [0056] これらをまとめると、本発明の方法は有利にも、多重化された、抗体に基づく単一検出および近接アッセイを使用して、容易にアクセス可能な腫瘍細胞について経路プロファイリングを実施することによって標的療法から利益が得られる可能性が最も高い癌患者（例えば、乳癌患者）の正確な選択および監視を提供する。] [0057] ＩＩ．用語の定義 本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特に規定しない限り、それらに与えられた意味を有する。] [0058] 用語「癌」は、異常細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患クラスの任意のメンバーを含めることが意図されている。この用語は、悪性、良性、軟組織、もしくは固形、または転移前および転移後癌を含むあらゆる病期および悪性度の癌のいずれであると特徴付けられようと、あらゆる公知の癌および腫瘍状態を含む。様々な癌のタイプの例には、乳癌；肺癌（例えば、非小細胞肺癌）；結腸直腸癌、消化管間質腫瘍、消化管カルチノイド腫瘍、結腸癌、直腸癌、肛門癌、胆管癌、小腸癌、および胃癌などの消化器および消化管癌；食道癌；胆嚢癌；肝臓癌；膵臓癌；虫垂癌；卵巣癌；腎臓癌（例えば、腎細胞癌）；中枢神経系の癌；皮膚癌；リンパ腫；絨毛腫；頭頸部癌；骨原性肉腫；ならびに血液癌が含まれるがそれらに限定されない。本明細書で使用する「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。１つの好ましい実施形態では、乳房腫瘍は、浸潤性もしくは非浸潤性の乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する。また別の好ましい実施形態では、乳房腫瘍は、再発性もしくは転移性乳癌を備える患者に由来する。] [0059] 用語「分析物」には、任意の当該の分子、典型的にはその存在、量、および／または同一性が決定される、ポリペプチドなどの高分子が含まれる。所定の場合には、分析物は、固形腫瘍の循環細胞の細胞成分、好ましくはシグナル伝達分子である。] [0060] 本明細書で使用する用語「希釈系列」は、特定サンプル（例えば、細胞溶解物）または試薬（例えば、抗体）の一連の減少する濃度を含むことが意図されている。希釈系列は、典型的には、低濃度のサンプルまたは試薬を作成するために測定された量の出発濃度のサンプルまたは試薬を希釈液（例えば、希釈緩衝液）と混合するプロセスと、さらに所望の数の連続希釈液を得るために十分な回数にわたり前記プロセスを繰り返す工程によって生成される。サンプルまたは試薬は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の下降濃度のサンプルまたは試薬を含む希釈系列を生成するために少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、５００、もしくは１，０００倍で連続的に希釈することができる。例えば、１ｍｇ／ｍＬの出発濃度で２倍の連続希釈率の捕捉抗体試薬を含む希釈系列は、０．５ｍｇ／ｍＬ濃度の捕捉抗体を作成するためにある量の出発濃度の捕捉抗体を等量の希釈緩衝液と混合する工程と、０．２５ｍｇ／ｍＬ、０．１２５ｍｇ／ｍＬ、０．０６２５ｍｇ／ｍＬ、０．０３２５ｍｇ／ｍＬなどの捕捉抗体濃度を得るために前記プロセスを繰り返すことによって生成できる。] [0061] 本明細書で使用する用語「優れたダイナミックレンジ」は、１個という少ない細胞内または数千個という多数の細胞内で特異的分析物を検出するためのアッセイの能力を意味する。例えば、本明細書に記載したイムノアッセイは、有利には希釈系列の捕捉抗体濃度を用いて約１〜１０，０００ｃｅｌｌｓ（例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、２５０、５００、７５０、１，０００、２，５００、５，０００、７，５００、もしくは１０，０００ｃｅｌｌｓ）中で当該の特定シグナル伝達分子を検出するので、優れたダイナミックレンジを有する。] [0062] 用語「シグナル伝達分子」もしくは「シグナル伝達物質」は、それにより細胞が細胞外シグナルもしくは刺激を応答に変換するプロセスであって、典型的には細胞の内部での順序付けられた生化学反応の順序を含むプロセスを実施するタンパク質およびその他の分子を含む。シグナル伝達分子の例には、例えばＥＧＦＲ（例えば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ−４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ−１／ＦＬＴ−１、ＶＥＧＦＲ−２／ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ−３／ＦＬＴ−４、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２、ＰＤＧＦＲ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連性受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１−４、ＨＧＦＲ１−２、ＣＣＫ４、ＴＲＫＡ−Ｃ、ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１−８、ＥＰＨＢ１−６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１−２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１−２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１−２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１−３、ＲＴＫ１０６などの受容体チロシンキナーゼ、例えばｐ９５ＥｒｂＢ２などの受容体チロシンキナーゼの切断形；例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、およびＬＩＭＫなどの非受容体チロシンキナーゼ；例えばＡｋｔ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ（例えば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ７０ Ｓ６キナーゼ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、ＰＤＫ、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＰＴＥＮ、ＲＳＫ１−３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、およびパキシリンなどのチロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分；例えばエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、鉱質コルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、およびオーファン受容体などの核ホルモン受容体；例えば各々乳癌−１（ＡＩＢ１）および核受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）内で増幅させられるような核受容体コアクチベーター類およびリプレッサー類；ならびにそれらの組み合わせなどが含まれるがそれらに限定されない。] [0063] 本明細書で使用する用語「循環細胞」は、固形腫瘍から転移した、または微小転移したいずれかである腫瘍外細胞を含む。循環細胞の例には、循環腫瘍細胞、癌幹細胞、および／または腫瘍へ移動中である細胞（例えば、循環内皮前駆細胞、循環内皮細胞、循環前血管新生骨髄性細胞、循環樹状細胞など）が含まれるがそれらに限定されない。] [0064] 本明細書で使用する用語「サンプル」は、患者から得られた任意の生物学的標本を含む。サンプルには、制限なく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば、末梢血単核球）、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液（例えば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、便（すなわち大便）、痰、気管支洗浄液、涙液、細針吸引液（例えば、無作為小室周囲細針吸引によって採取される）、任意の他の体液、例えば腫瘍の生検（例えば、針生検）もしくはリンパ節（例えば、センチネルリンパ節生検）の生検などの組織サンプル（例えば、腫瘍組織）、ならびにそれらの細胞抽出液が含まれる。一部の実施形態では、サンプルは、全血または例えば血漿、血清、もしくは細胞ペレットなどのそれらの分画成分である。好ましい実施形態では、サンプルは、当業者には公知である任意の技術を使用して全血またはその細胞分画から固形腫瘍の循環細胞を単離することによって入手される。他の実施形態では、サンプルは、例えば乳房の固形腫瘍由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織サンプルである。] [0065] 「生検」は、診断的もしくは予後診断的評価のために組織サンプルを切除する工程および組織標本自体を意味する。当分野において公知の任意の生検技術は、本発明の方法および組成物に適用することができる。適用される生検技術は、一般には、他の因子の中でも特に、評価対象の組織タイプ、ならびに腫瘍のサイズおよびタイプ（すなわち、固形もしくは浮遊型（すなわち、血液もしくは腹水））に依存するであろう。代表的な生検技術には、切除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、細針吸引生検など）、外科生検、および骨髄生検が含まれる。生検技術については、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋａｓｐｅｒら編集、第１６版、２００５年、第７０章、および第Ｖ部全体において考察されている。当業者であれば、所定の組織サンプル中で癌性および／または前癌性細胞を同定するために生検技術を実施できることを理解するであろう。] [0066] 用語「被験者」または「患者」または「個人」は、典型的にはヒトを含むが、さらに例えば他の霊長類、齧歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの他の動物も含むことができる。] [0067] 「アレイ」もしくは「マイクロアレイ」は、例えば、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、ポリスチレンビーズなど）、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、または任意の他の適切な基質などの固体支持体上に固相化もしくは固定された個別セットおよび／または希釈系列の捕捉抗体を含む。捕捉抗体は、一般に共有または非共有相互作用（例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）力、双極子間結合）を介して固体支持体上に固相化または固定される。所定の場合には、捕捉抗体は、固体支持体に結合した捕捉剤と相互作用する捕捉タグを含む。本発明のアッセイにおいて使用されるアレイは、典型的には、複数の異なる捕捉抗体および／または異なる公知／アドレス可能な場所で固体支持体の表面に結合している捕捉抗体濃度を含む。] [0068] 用語「捕捉抗体」は、例えば固形腫瘍の循環細胞の細胞抽出物などのサンプル中の１つ以上の当該の分析物に対して特異的である（すなわち、結合する、それに結合される、または複合体をともに形成する）固相化された抗体を含むことが意図されている。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、アレイ内の固体支持体上に固定される。固体支持体上に様々なシグナル伝達分子のいずれかを固定化するのに適切な捕捉抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ社（カリフォルニア州テメキュラ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マサチューセッツ州ダンバーズ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社（カリフォルニア州フレモント）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）、およびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ）から入手できる。] [0069] 本明細書で使用する用語「検出抗体」は、サンプル中の当該の１つ以上の分析物に対して特異的である（すなわち、結合する、それに結合される、または複合体をともに形成する）検出可能な標識を含む抗体を含む。この用語はさらに、当該の１つ以上の分析物に対して特異的である抗体を含み、前記抗体は検出可能な標識を含むまた別の種に結合されることができる。検出可能な標識の例には、ビオチン／ストレプトアビジン標識、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）標識、化学的に反応性の標識、蛍光標識、酵素標識、放射活性標識、ならびにそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。様々なシグナル伝達分子のいずれかの活性化状態および／または総量を検出するのに適切な検出抗体は、Ｕｐｓｔａｔｅ社（カリフォルニア州テメキュラ）、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社（カリフォルニア州カマリロ）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（マサチューセッツ州ダンバーズ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州ミネアポリス）、Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ社（カリフォルニア州フレモント）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（カリフォルニア州サンタクルーズ）、Ｓｉｇｍａ社（ミズーリ州セントルイス）、およびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（カリフォルニア州サンノゼ）から入手できる。非限定的な例として、例えばＥＧＦＲ、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−Ｓｒｃ、ＦＬＫ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｋｔ、ＭＡＰＫ、ＰＴＥＮ、Ｒａｆ、およびＭＥＫなどのシグナル伝達分子の様々なリン酸化形に対するリン特異的抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手できる。] [0070] 用語「活性化状態依存性抗体」は、サンプル中の当該の１つ以上の分析物の特定活性化状態に対して特異的である（すなわち、結合する、それに結合される、または複合体をともに形成する）検出抗体を含む。好ましい実施形態では、活性化状態依存性抗体は、例えば１つ以上のシグナル伝達分子などの１つ以上の分析物のリン酸化、ユビキチン化、および／または複合体形成状態を検出する。一部の実施形態では、受容体チロシンキナーゼのＥＧＦＲファミリーのメンバーのリン酸化および／またはＥＧＦＲファミリーメンバー間のヘテロ二量体複合体の形成は、活性化状態依存性抗体を用いて検出される。活性化状態依存性抗体を用いて検出するのに適切な活性化状態（括弧内に列挙した）の非限定的例には：ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ９５：切断（Ｔｒ）−ＥｒｂＢ２、ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５：Ｔｒ−ｐ−ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ（Ｓ１１８、Ｓ１６７）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＫＩＴ（ｐ−ＫＩＴ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲＩ（ｐ−ＨＧＦＲＩ）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲａ（ｐ−ＰＤＧＦＲａ）；ＰＤＧＦＲＰ（ｐ−ＰＤＧＦＲＰ）；ＶＥＧＦＲＩ（ｐ−ＶＥＧＦＲＩ、ＶＥＧＦＲＩ：ＰＬＣｇ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣｙ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：ヘパリン硫酸、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；Ｔｉｅｌ（ｐ−Ｔｉｅｌ）；Ｔｉｅ２（ｐ−Ｔｉｅ２）；ＥｐｈＡ（ｐ−ＥｐｈＡ）；ＥｐｈＢ（ｐ−ＥｐｈＢ）；ＮＦＫＢおよび／またはＩＫＢ（ｐ−ＩＫ（Ｓ３２）、ｐ−ＮＦＫＢ（Ｓ５３６）、ｐ−Ｐ６５：ＩＫＢａ）；Ａｋｔ（ｐ−Ａｋｔ（Ｔ３０８、Ｓ４７３））；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｂａｄ（ｐ−Ｂａｄ（Ｓ１１２、Ｓ１３６）、Ｂａｄ：１４−３−３）；ｍＴｏｒ（ｐ−ｍＴｏｒ（Ｓ２４４８））；ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ２２９、Ｔ３８９））；Ｍｅｋ（ｐ−Ｍｅｋ（Ｓ２１７、Ｓ２２１））；Ｅｒｋ（ｐ−Ｅｒｋ（Ｔ２０２、Ｙ２０４））；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１（Ｔ３５７、Ｓ３６３））；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ（Ｔ１８３、Ｙ１８５））；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８（Ｔ１８０、Ｙ１８２））；Ｓｔａｔ３（ｐ−Ｓｔａｔ−３（Ｙ７０５、Ｓ７２７））；Ｆａｋ（ｐ−Ｆａｋ（Ｙ５７６））；Ｒｂ（ｐ−Ｒｂ（Ｓ２４９、Ｔ２５２、Ｓ７８０））；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３（Ｓ３９２、Ｓ２０））；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ（Ｓ１３３））；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ（Ｓ６３））；ｃＳｒｃ（ｐ−ｃＳｒｃ（Ｙ４１６））；およびパキシリン（ｐ−パキシリン（Ｙ１１８））が含まれる。] [0071] 用語「活性化状態非依存性抗体」は、それらの活性化状態とは無関係にサンプル中の当該の１つ以上の分析物の特定活性化状態に対して特異的である（すなわち、結合する、それに結合される、または複合体をともに形成する）検出抗体を含む。例えば、活性化状態非依存性抗体は、例えば１つ以上のシグナル伝達分子などの１つ以上の分析物のリン酸化および非リン酸化形の両方を検出することができる。] [0072] 用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの一本鎖または二本鎖形いずれかにあるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを含む。核酸には、合成、天然型、および非天然型である、ならびに参照核酸と類似の結合特性を有する、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾バックボーン残基もしくはリンケージを含有する核酸が含まれる。そのようなアナログの例には、制限なく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、およびペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。特別に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を含む。他に特に規定しない限り、特定核酸配列は、さらにまた黙示的に保存的に修飾されたそれらの変異体および相補的配列ならびに明示的に指示された配列を含む。] [0073] 用語「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、および／またはそれらのミメティックの一本鎖オリゴマーもしくはポリマーを意味する。所定の場合には、オリゴヌクレオチドは、天然型（すなわち、未修飾）核酸塩基、糖、およびインターヌクレオシド（バックボーン）結合から構成される。所定の他の場合には、オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸塩基、糖、および／またはインターヌクレオシド結合を含む。] [0074] 本明細書で使用する用語「ミスマッチモチーフ」もしくは「ミスマッチ領域」は、その相補的配列に対して１００％相補性を有していないオリゴヌクレオチドの一部分を意味する。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６以上のミスマッチ領域を有してもよい。ミスマッチ領域は、連続してもよい、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２以上のヌクレオチドによって分離されてもよい。ミスマッチモチーフもしくは領域は、単一ヌクレオチドを含んでもよい、または２、３、４、５以上のヌクレオチドを含んでもよい。] [0075] 語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、オリゴヌクレオチドがその相補性配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なるであろう。長い配列は、詳細には高温でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広汎な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ」（１９９３）において見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨで特異的配列に対して熱融点（Ｔｍ）より約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、標的に相補的であるプローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態で占められる）で標的配列にハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、ｐＨ、および核濃度下で）である。ストリンジェントな条件は、さらにまたホルムアミドなどの不安定化剤を添加して達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。] [0076] 用語「実質的に同一」もしくは「実質的同一性」は、２つ以上の核酸の状況においては、配列比較アルゴリズムを用いて、または手動アラインメントおよび目視検査によって測定したように比較窓もしくは指定領域にわたって最高対応について比較およびアライメントした場合に、同一であるまたは同一である規定パーセンテージのヌクレオチド（すなわち、規定領域にわたって少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性）を有する２つ以上の配列を意味する。この定義は、その状況が示す場合は、配列の相補体を同様に意味する。好ましくは、実質的同一性は、長さが少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、または１００ヌクレオチドである領域にわたって存在する。] [0077] 用語「インキュベートする工程」は、「接触させる工程」および「曝露させる工程」と同義的に使用され、他に規定しない限り任意の特定の時間または温度要件を意味しない。] [0078] ＩＩＩ．実施形態の説明 １つの実施形態では、本発明は、特異的多重高スループットアッセイにおいて固形腫瘍の腫瘍組織に由来する腫瘍細胞または循環細胞中での複数の無秩序のシグナル伝達物質の発現および活性化状態を検出するための方法を提供する。本発明は、１つ以上の無秩序なシグナル伝達経路をダウンレギュレートまたは活動停止させるために適切な療法を選択するための方法および組成物もさらに提供する。そこで、本発明の実施形態は、所定の患者の腫瘍において活性化されたシグナル伝達タンパク質の収集によって提供される特定分子シグニチャーに基づいて個別の療法の設計を促進するために使用できる。] [0079] 固形腫瘍の循環細胞には、癌幹細胞もしくは腫瘍に（例えば、化学誘因に起因して）移動中である細胞、例えば内皮前駆細胞、循環内皮細胞、周皮細胞、循環前血管新生性骨髄性細胞、樹状細胞などの、固形腫瘍から転移した、または微小転移したのいずれかである細胞が含まれる。循環細胞を含有する患者サンプルは、任意の接近可能な生体液（例えば、全血、血清、血漿、痰、気管支洗浄液、尿、乳頭吸引液、リンパ液、唾液、細針吸引液など）から入手できる。所定の場合には、全血サンプルは、血漿もしくは血清分画および細胞分画（すなわち、細胞ペレット）に分離される。細胞分画は、典型的には、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、循環内皮細胞（ＣＥＣ）、循環内皮前駆細胞（ＣＥＰＣ）、癌幹細胞（ＣＳＣ）、リンパ節の播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせなどの、固形腫瘍の赤血球、白血球、および／または循環細胞を含有する。血漿または血清分画は、通常は、特に、固形腫瘍の循環細胞によって遊離される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質を含有する。] [0080] 循環細胞は、典型的には、例えば免疫磁気分離法（例えば、Ｒａｃｉｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４５８９−４５９４（１９９８）；Ｂｉｌｋｅｎｒｏｔｈら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９２：５７７−５８２（２００１）を参照されたい）、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社（ペンシルバニア州ハンティントン・バレー）によるＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）システム、マイクロ流体分離法（例えば、Ｍｏｈａｍｅｄら、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．Ｎａｎｏｂｉｏｓｃｉ．，３：２５１−２５６（２００４）；Ｌｉｎら、Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．５１４７，９７ｔｈ ＡＡＣＲＡｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（２００６））、ＦＡＣＳ（例えば、Ｍａｎｃｕｓｏら、Ｂｌｏｏｄ，９７：３６５８−３６６１（２００１））、密度勾配遠心分離法（例えば、Ｂａｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１３：４８６５−４８７１（２００３））、および枯渇法（例えば、Ｍｅｙｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２１：５２１−５３０（２００２）を参照されたい）を含む１つ以上の分離方法を使用して患者サンプルから単離される。] [0081] インサイチュー活性化状態を維持するために、シグナル伝達物質は、有利には細胞が単離された直後に、好ましくは９６、７２、４８、２４、６、もしくは１時間以内に、より好ましくは３０、１５、もしくは５分間以内に抽出される。単離した細胞は、有利には、さらにまた通常はナノモル〜ミクロモル濃度の１つ以上の成長因子とともに、シグナル伝達物質の活性化を復活させる、または刺激するために約１〜３０分間にわたりインキュベートすることもできる（例えば、Ｉｒｉｓｈら、Ｃｅｌｌ，１１８：２１７−２２８（２００４）を参照されたい）。刺激性成長因子には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ＴＧＦ−α、ＰＩＧＦ、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＮＲＧ１、ＰＧＦ、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、サイトカインなどが含まれる。個別患者のための潜在的抗癌療法を評価するためには、成長因子を刺激する前に、単離した細胞を様々な用量の１つ以上の抗癌剤とインキュベートすることができる。成長因子の刺激は、数分間または数時間（例えば、１〜５分間から１〜６時間）にわたり実施することができる。抗癌剤を用いた、および用いないシグナル伝達経路の示差的活性化は、各個別患者のために適正用量で適切な癌療法の選択において役立つ。単離、抗癌剤治療、および／または成長因子刺激後には、細胞は当分野において公知の任意の技術を用いてシグナル伝達物質を抽出するために溶解させられる。好ましくは、細胞溶解は、成長因子刺激の約１〜３６０分間後に、およびより好ましくは２つの異なる時間間隔で：（１）成長因子刺激の約１〜５分間後；および（２）成長因子刺激の約３０〜１８０分間後に開始される。または、溶解物は、使用時まで−８０℃で保存することができる。] [0082] 一部の実施形態では、抗癌剤は、癌細胞中の活性化シグナル伝達経路成分の機能を妨害する物質を含む。そのような作用物質の非限定的な例には、以下の表１に列挙した作用物質が含まれる。] [0083] また別の実施形態では、本発明は、固体支持体上に固定された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアドレス可能なアレイであって、各希釈系列中の捕捉抗体はシグナル伝達経路の成分および他の標的タンパク質に対応する１つ以上の分析物に対して特異的であるアレイを提供する。様々な態様では、この実施形態は、特定の腫瘍に特徴的なシグナル伝達経路、例えば乳癌細胞中で活性なシグナル伝達経路の成分を含むアレイを含む。そこで本発明は、有利にも、癌を誘発する潜在的発現もしくは活性化欠損を備える当該の各シグナル伝達分子または他のタンパク質が単一アレイもしくはチップ上で提示されるように実施することができる。一部の態様では、特定腫瘍細胞中で活性な所定のシグナル伝達経路の成分は、細胞内のシグナル伝達経路を通って情報が伝えられる配列に対応する直鎖状配列で整列させられる。そのようなアレイの例は、図５から図９に示した。特定腫瘍細胞中で活性な所定のシグナル伝達経路の１つ以上の成分に対して特異的な捕捉抗体は、さらにまたあらゆる表面関連アーチファクトを最小限に抑えるために無作為方法でプリントすることもできる。] 図５ 図９ [0084] 本発明を使用して調べる（interrogated）ことのできるシグナル伝達経路の非限定的な例には、表２に示したものが含まれる。] [0085] 所定の実施形態では、抗癌剤は、例えばモノクローナル抗体もしくはチロシンキナーゼ阻害剤などの抗シグナル伝達剤（すなわち、細胞増殖抑制薬）；抗増殖剤；化学療法薬（すなわち、細胞毒性薬）；ホルモン治療薬；放射線療法薬；ワクチン；および／または例えば癌性細胞などの異常な細胞の制御されない増殖を減少または無効にさせる能力を備える任意の他の化合物を含む。一部の実施形態では、単離された循環細胞は、少なくとも１つの化学療法薬と組み合わせて１つ以上の抗シグナル伝達剤、抗増殖剤、および／またはホルモン治療薬を用いて治療される。] [0086] 本発明において使用するのに適切な抗シグナル伝達剤の例には、制限なく、例えばトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商品名））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、およびトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））などのモノクローナル抗体；例えばゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ラパチニブ（ＧＷ−５７２０１６；Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６；Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、およびバンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商品名）；ＺＤ６４７４）などのチロシンキナーゼ阻害剤；ならびにそれらの組み合わせが含まれる。] [0087] 典型的な抗増殖剤には、例えばシロリムス（ラパマイシン）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、およびエベロリムス（ＲＡＤ００１）などのｍＴＯＲ阻害剤；例えば１Ｌ６−ヒドロキシメチル−キロ−イノシトール−２−（Ｒ）−２−Ｏ−メチル−３−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロカーボネート、９−メトキシ−２−メチルエリプチシニウムアセテート、１，３−ジヒドロ−１−（１−（（４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル）メチル）−４−ピペリジニル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン、１０−（４’−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル）−２−クロロフェノキサジン、３−ホルミルクロモンチオセミカルバゾン（Ｃｕ（ＩＩ）Ｃｌ２複合体）、癌原遺伝子ＴＣＬ１のアミノ酸１０〜２４に由来する１５−ｍｅｒペプチドであるＡＰＩ−２（Ｈｉｒｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：５３４０７−５３４１８（２００４）、ＫＰ３７２−１、およびＫｏｚｉｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：１１４４−１１４５（２００３）およびＫａｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，４：４６３−４７６（２００３）に記載の化合物などのＡｋｔ阻害剤；ならびにそれらの組み合わせが含まれる。] [0088] 化学療法薬の非限定的な例には、白金に基づく薬物（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレアなど）、代謝拮抗薬（例えば、５−フルオロウラシル、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））など）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。] [0089] ホルモン治療薬の例には、制限なく、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））、ボロゾール、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標））、４−アンドロステン−３，６，１７−トリオン（６−ＯＸＯ）、１，４，６−アンドロスタトリエン−３，１７−ジオン（ＡＴＤ）、フォルメスタン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ（登録商標））など）、選択的エストロゲン受容体調節剤（例えば、バゼドキシフェン、クロミフェン、フルベストラント、ラソフォキシフェン、ラロキシフェン、タモキシフェン、トレミフェンなど）、ステロイド剤（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、およびゴセレリンなどのゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。] [0090] 本発明において有用な癌ワクチンの非限定的な例には、Ａｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社からのＡＮＹＡＲＡ、Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社からのＤＣＶａｘ−ＬＢ、ＩＤＭＰｈａｒｍａ社からのＥＰ−２１０１、Ｐｈａｒｍｅｘａ社からのＧＶ１００１、Ｉｄｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社からのＩＯ−２０５５、Ｉｎｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社からのＩＮＧＮ ２２５およびＢｉｏｍｉｒａ／Ｍｅｒｃｋ社からのＳｔｉｍｕｖａｘが含まれる。] [0091] 放射線療法薬の例には、制限なく、腫瘍抗原に向けられた抗体に任意で結合させた、例えば４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉなどの放射性核種が含まれる。] [0092] 一部の実施形態では、各希釈系列の捕捉抗体は、一連の下降する捕捉抗体濃度を含む。所定の場合には、捕捉抗体は、アレイ上にスポットされる１セット数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）の下降する捕捉抗体濃度を含む希釈系列を生成するために少なくとも２倍（例えば、２、５、１０、２０、５０、１００、５００、もしくは１，０００倍）で連続的に希釈される。好ましくは、各捕捉抗体希釈液が少なくとも２、３、４、５、または６回ずつアレイ上にスポットされる。] [0093] 他の実施形態では、固体支持体は、ガラス（例えば、ガラススライド）、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜（例えば、ナイロン、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）など）、繊維束、または任意の他の適切な基質を含む。好ましい実施形態では、捕捉抗体は、例えばＷｈａｔｍａｎ社（ニュージャージー州フローラムパーク）から市販で入手できるＦＡＳＴ（登録商標）スライドなどの、ニトロセルロースポリマーでコーティングされたガラススライド上に（例えば、共有結合もしくは非共有結合相互作用によって）固定される。] [0094] 一部の実施形態では、細胞抽出物は、固形腫瘍の循環細胞の抽出物を含む。循環細胞は、典型的には、例えば、免疫磁気分離法、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）システム、マイクロ流体分離法、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離法、および枯渇法を含む、当分野において公知の１つ以上の分離法を用いて患者サンプルから単離される。] [0095] 他の実施形態では、患者サンプルは、例えば、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、および／または細針吸引液サンプルなどの体液サンプルを含む。所定の場合には、全血サンプルは、血漿もしくは血清分画および細胞分画（すなわち、細胞ペレット）に分離される。細胞分画は、典型的には、ＣＴＣ、ＣＥＣ、ＣＥＰＣ、リンパ節の播種性腫瘍細胞、および／またはＣＳＣなどの、固形腫瘍の赤血球、白血球、および／または循環細胞を含有する。血漿または血清分画は、通常は、特に、固形腫瘍の循環細胞によって遊離される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）およびタンパク質を含有する。] [0096] 一部の場合には、単離された循環細胞は、１つ以上の当該の抗癌剤を用いたインキュベーションの前、中、および／または後に１つ以上の成長因子を用いてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で刺激することができる。刺激性成長因子については上記に記載した。他の場合には、単離された循環細胞は、当分野において公知の任意の技術を用いて細胞抽出物（例えば、細胞溶解物）を生成するために、例えば成長因子の刺激および／または抗癌剤処理に続いて、溶解させることができる。好ましくは、細胞溶解は、成長因子刺激の約１〜３６０分間後に、およびより好ましくは２つの異なる時間間隔をあけて：（１）成長因子刺激約１〜５分間後；および（２）成長因子刺激の約３０〜１８０分間後に開始される。または、細胞溶解物は、使用時まで−８０℃で保存することができる。] [0097] 好ましい実施形態では、例えば固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞中の複数のシグナル伝達分子の発現および／または活性化状態は、下記で記載するように単一検出または近接二重検出アッセイを用いて検出される。] [0098] したがって、１つの態様では、本発明は、乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と；および （ｄ）前記抗癌剤が、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法を提供する。] [0099] 所定の場合には、本発明の方法は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｄ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。所定の他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｄ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0100] 好ましい実施形態では、乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療のために適切であることを指示する工程と、を含む。] [0101] 所定の場合には、好ましい実施形態は、工程（ｆ）として、または工程（ｅ）として、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少していない場合は、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療のために不適切であることを指示する工程をさらに含むことができる。] [0102] 所定の他の場合には、好ましい実施形態は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｅ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。さらになお他の場合には、好ましい実施形態は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｅ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0103] 一部の実施形態では、例えばシグナル伝達分子などの分析物の活性化状態は、抗癌剤の非存在下におけるより少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％未満活性化されている場合は、抗癌剤の存在下において「実質的に減少している」と見なされる。他の実施形態では、例えばシグナル伝達分子などの分析物の活性化状態は、（１）抗癌剤を用いない場合の分析物の高もしくは強活性化から抗癌剤を用いる場合の分析物の中、弱、低、もしくは超弱活性化への変化が見られる場合、または（２）抗癌剤を用いない場合の分析物の中活性化から抗癌剤を用いた場合の分析物の弱、低、もしくは超弱活性化への変化が見られる場合に、抗癌剤の存在下において「実質的に減少している」と見なされる。] [0104] 一部の実施形態では、本発明の方法は、乳房腫瘍の細胞が単離される乳房腫瘍を有する被験者からサンプルを入手する工程をさらに含むことができる。サンプルは、乳癌被験者から、抗癌剤治療の前（例えば、抗癌剤を用いたインキュベーションの前）または抗癌剤の投与後（例えば、癌治療の経過を通していずれかの時点に）入手することができる。適切なサンプルには、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、サンプルは、全血またはＦＮＡサンプルである。この実施形態では、乳房腫瘍の循環細胞は全血サンプルから単離できる、または乳癌細胞はＦＮＡサンプルから単離できる。単離した細胞が抗癌剤を用いた治療を受けていない被験者から入手される場合は、単離した細胞は、工程（ｃ）において検出すべき１つ以上の分析物を標的とする抗癌剤の１つまたはカクテルとインビトロの適切な条件下でインキュベートすることができる。] [0105] 乳房腫瘍の循環細胞は、当分野において任意の公知の技術によって、例えば、免疫磁気分離法、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）システム、マイクロ流体分離法、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離法、および枯渇法によってサンプルから単離することができる（実施例１を参照されたい）。サンプルから単離できる循環細胞の例には、制限なく、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせが含まれる。例えば循環細胞などの単離した細胞は、当分野において公知である任意の技術によって単離した細胞を細胞抽出物へ転換させるために溶解させることができる（実施例１を参照されたい）。] [0106] １つの実施形態では、乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する。乳管癌の例には、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌が含まれるがそれらに限定されない。小葉癌の非限定的な例には、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌が含まれる。] [0107] 所定の場合には、乳房腫瘍の細胞は、腫瘍組織から単離される。腫瘍組織は、例えば、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織であってもよい。１つの好ましい実施形態では、細胞は、細針吸引液（ＦＮＡ）サンプルとして腫瘍組織から単離される。] [0108] 一部の実施形態では、単離した細胞は、本明細書に記載したように成長因子を用いてインビトロで刺激される。他の実施形態では、抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン治療薬、放射線療法薬、およびワクチンを含むがそれらに限定されない、本明細書に記載した１つ以上の治療薬を含むことができる。] [0109] 好ましい実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む。シグナル伝達分子の例には、制限なく、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、およびそれらの組み合わせが含まれる。所定の場合には、複数のシグナル伝達分子は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ−４（ＥｒｂＢ４）、Ｒａｆ、ＳＲＣ、Ｍｅｋ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴｏｒ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｅｐｈ−ａ、Ｅｐｈ−ｂ、Ｅｐｈ−ｃ、Ｅｐｈ−ｄ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｔ−３、ｃＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、Ｋｉｔ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、複数のシグナル伝達分子は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＥＲ、ＰＲ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。] [0110] 一部の実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物について検出された活性化状態は、例えば、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。他の実施形態では、固体支持体は、例えば、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせを含むことができる。さらに他の実施形態では、捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される。] [0111] 所定の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる）ために前記細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0112] 一部の場合には、活性化状態依存性抗体は、結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含む。他の場合には、シグナル増幅対の第１メンバー（例えば、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ）は、結合対の第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。所定の場合には、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォア、およびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0113] 所定の他の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる）ために前記細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、 前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーへチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、 （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0114] 活性化状態非依存性抗体は、促進成分を用いて直接的に標識できる、または促進成分を用いて、例えば活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１メンバーを用いて直接的に標識することができる、またはシグナル増幅対の第１メンバーを用いて、例えば活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第１メンバーとシグナル増幅対の第１メンバーに結合された結合対の第２メンバーとの間の結合によって間接的に標識することができる。所定の場合には、結合対の第１メンバーはビオチンであり、結合対の第２メンバーは、例えばストレプトアビジンまたはニュートラビジンなどのアビジンである。] [0115] 一部の実施形態では、促進成分は、例えば、グルコースオキシダーゼであってもよい。所定の場合には、グルコースオキシダーゼおよび活性化状態非依存性抗体は、例えば実施例１６および１７に記載したように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、または７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってもよい。さらにまた別の実施形態では、シグナル増幅対の第１メンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってもよい。別の実施形態では、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォアおよびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0116] 所定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび活性化状態依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｋＤａ）の分子量を有する。] [0117] 一部の実施形態では、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療のために適切な抗癌剤の選択を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、乳房腫瘍の治療のために適切な抗癌剤の選択を改善するために有用な可能性がある。] [0118] また別の態様では、本発明は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法を提供する。] [0119] 所定の場合には、本発明の方法は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｄ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。所定の他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｄ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0120] 好ましい実施形態では、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性であることを指示する工程と、を含む。] [0121] 所定の場合には、好ましい実施形態は、すなわち工程（ｆ）として、または工程（ｅ）として、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少していない場合は、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に対して非応答性であることを指示する工程をさらに含むことができる。] [0122] 所定の他の場合には、好ましい実施形態は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｅ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。さらになお他の場合には、好ましい実施形態は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｅ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0123] 分析物（例えば、シグナル伝達分子）の活性化状態は、上述したように抗癌剤の存在下では「実質的に減少している」可能性がある。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、それから乳癌細胞が単離される乳房腫瘍を有する被験者からサンプルを入手する工程をさらに含むことができる。サンプルは、乳癌被験者から、抗癌剤治療の前（例えば、抗癌剤を用いたインキュベーションの前）または抗癌剤の投与後（例えば、癌治療の経過を通していずれかの時点に）入手することができる。適切なサンプルには、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、サンプルは、全血またはＦＮＡサンプルである。この実施形態では、乳房腫瘍の循環細胞は全血サンプルから単離できる、または乳癌細胞はＦＮＡサンプルから単離できる。単離した細胞が抗癌剤を用いた治療を受けていない被験者から入手される場合は、単離した細胞は、工程（ｃ）において検出すべき１つ以上の分析物を標的とする抗癌剤の１つまたはカクテルを用いた適切な条件下においてインビトロでインキュベートすることができる。] [0124] 乳房腫瘍の循環細胞は、当分野において任意の公知の技術によって、例えば、免疫磁気分離法、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）システム、マイクロ流体分離法、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離法、および枯渇法によってサンプルから単離することができる（実施例１を参照されたい）。サンプルから単離できる循環細胞の例には、制限なく、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせが含まれる。例えば循環細胞などの単離した細胞は、当分野において公知である任意の技術によって単離した細胞を細胞抽出物へ転換させるために溶解させることができる（実施例１を参照されたい）。] [0125] 一部の実施形態では、乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する。乳管癌の例には、浸潤性乳管癌および非浸潤性乳管癌が含まれるがそれらに限定されない。小葉癌の非限定的な例には、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌が含まれる。] [0126] 所定の場合には、乳房腫瘍の細胞は、腫瘍組織から単離される。腫瘍組織は、例えば、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織であってもよい。１つの好ましい実施形態では、細胞は、細針吸引液（ＦＮＡ）サンプルとして腫瘍組織から単離される。] [0127] 一部の実施形態では、単離した細胞は、本明細書に記載したように成長因子を用いてインビトロで刺激される。他の実施形態では、抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン治療薬、放射線療法薬、およびワクチンを含むがそれらに限定されない、本明細書に記載した１つ以上の治療薬を含むことができる。] [0128] 好ましい実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む。シグナル伝達分子の例には、制限なく、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、およびそれらの組み合わせが含まれる。所定の場合には、複数のシグナル伝達分子は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ−４（ＥｒｂＢ４）、Ｒａｆ、ＳＲＣ、Ｍｅｋ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴｏｒ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｅｐｈ−ａ、Ｅｐｈ−ｂ、Ｅｐｈ−ｃ、Ｅｐｈ−ｄ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｔ−３、ｃＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、Ｋｉｔ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、複数のシグナル伝達分子は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＥＲ、ＰＲ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。] [0129] 一部の実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物について検出された活性化状態は、例えば、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。他の実施形態では、固体支持体は、例えば、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、またはそれらの組み合わせを含むことができる。さらに他の実施形態では、捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される。] [0130] 所定の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる）ために、前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0131] 一部の場合には、活性化状態依存性抗体は、結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含む。他の場合には、シグナル増幅対の第１メンバー（例えば、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ）は、結合対の第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。所定の場合には、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォア、およびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0132] 所定の他の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる）ために細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために前記複数の捕捉分析物を、複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、 前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、 （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0133] 活性化状態非依存性抗体は、促進成分を用いて直接的に標識できる、または促進成分を用いて、例えば活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１メンバーを用いて直接的に標識することができる、またはシグナル増幅対の第１メンバーを用いて、例えば活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第１メンバーとシグナル増幅対の第１メンバーに結合された結合対の第２メンバーとの間の結合によって間接的に標識することができる。所定の場合には、結合対の第１メンバーはビオチンであり、結合対の第２メンバーは、例えばストレプトアビジンまたはニュートラビジンなどのアビジンである。] [0134] 一部の実施形態では、促進成分は、例えば、グルコースオキシダーゼであってもよい。所定の場合には、グルコースオキシダーゼおよび活性化状態非依存性抗体は、例えば実施例１６および１７に記載したように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、または７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってもよい。さらにまた別の実施形態では、シグナル増幅対の第１メンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってもよい。別の実施形態では、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォア、およびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0135] 所定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび活性化状態依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｋＤａ）の分子量を有する。] [0136] 一部の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答の同定を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答の同定を改良するために有用な可能性がある。] [0137] さらにまた別の態様では、本発明は、乳房腫瘍を有する被験者の抗癌剤を用いた治療への応答を予測するための方法であって： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法を提供する。] [0138] 所定の場合には、本発明の方法は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｄ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。所定の他の場合には、本発明の方法は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｄ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0139] 好ましい実施形態では、乳房腫瘍を有する被験者の抗癌剤を用いた治療への応答を予測するための方法は： （ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と； （ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と； （ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と； （ｅ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性が高いことを指示する工程と、を含む。] [0140] 所定の場合には、好ましい実施形態は、すなわち工程（ｆ）として、または工程（ｅ）として、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態が対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少していない場合は、被験者が抗癌剤による治療に対して応答する可能性が低い（例えば、応答する機会を有していない、または応答する確率が低い）ことを指示する工程をさらに含むことができる。] [0141] 所定の他の場合には、好ましい実施形態は、医師、例えば癌専門医または一般開業医に工程（ｅ）の結果を送る、または報告する工程をさらに含むことができる。さらになお他の場合には、好ましい実施形態は、コンピュータデータベースもしくは他の適切な機械、または例えば研究所で情報を保存するためのデバイスに工程（ｅ）の結果を記録または保存する工程をさらに含むことができる。] [0142] 分析物（例えば、シグナル伝達分子）の活性化状態は、上述したように抗癌剤の存在下では「実質的に減少している」可能性がある。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法は、それから乳癌細胞が単離される乳房腫瘍を有する被験者からサンプルを入手する工程をさらに含むことができる。サンプルは、乳癌被験者から、抗癌剤治療の前（例えば、抗癌剤を用いたインキュベーションの前）または抗癌剤の投与後（例えば、癌治療の経過を通していずれかの時点）に入手することができる。適切なサンプルには、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液（ＦＮＡ）、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、サンプルは、全血またはＦＮＡサンプルである。この実施形態では、乳房腫瘍の循環細胞は全血サンプルから単離できる、または乳癌細胞はＦＮＡサンプルから単離できる。単離した細胞が抗癌剤を用いた治療を受けていない被験者から入手される場合は、前記単離した細胞は、工程（ｃ）において検出すべき１つ以上の分析物を標的とする抗癌剤の１つまたはカクテルを用いた適切な条件下においてインビトロでインキュベートすることができる。] [0143] 乳房腫瘍の循環細胞は、当分野において任意の公知の技術によって、例えば、免疫磁気分離法、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ（登録商標）システム、マイクロ流体分離法、ＦＡＣＳ、密度勾配遠心分離法、および枯渇法によってサンプルから単離することができる（実施例１を参照されたい）。サンプルから単離できる循環細胞の例には、制限なく、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせが含まれる。例えば循環細胞などの単離した細胞は、当分野において公知である任意の技術によって単離した細胞を細胞抽出物へ転換させるために溶解させることができる（実施例１を参照されたい）。] [0144] 一部の実施形態では、乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する。乳管癌の例には、浸潤性乳管癌および非浸潤性乳管癌が含まれるがそれらに限定されない。小葉癌の非限定的な例には、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌が含まれる。] [0145] 所定の場合には、乳房腫瘍の細胞は、腫瘍組織から単離される。腫瘍組織は、例えば、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織であってもよい。１つの好ましい実施形態では、細胞は、細針吸引液（ＦＮＡ）サンプルとして腫瘍組織から単離される。] [0146] 一部の実施形態では、単離した細胞は、本明細書に記載したように成長因子を用いてインビトロで刺激される。他の実施形態では、抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン治療薬、放射線療法薬、およびワクチンを含むがそれらに限定されない、本明細書に記載した１つ以上の治療薬を含むことができる。] [0147] 好ましい実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む。シグナル伝達分子の例には、制限なく、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、およびそれらの組み合わせが含まれる。所定の場合には、複数のシグナル伝達分子は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ−４（ＥｒｂＢ４）、Ｒａｆ、ＳＲＣ、Ｍｅｋ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴｏｒ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｅｐｈ−ａ、Ｅｐｈ−ｂ、Ｅｐｈ−ｃ、Ｅｐｈ−ｄ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｔ−３、ｃＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、Ｋｉｔ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。好ましくは、複数のシグナル伝達分子は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＥＲ、ＰＲ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。] [0148] 一部の実施形態では、細胞抽出物中に存在する１つ以上の分析物について検出された活性化状態は、例えば、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。他の実施形態では、固体支持体は、例えば、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせを含むことができる。さらに他の実施形態では、捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される。] [0149] 所定の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる）ために前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0150] 一部の場合には、活性化状態依存性抗体は、結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含む。他の場合には、シグナル増幅対の第１メンバー（例えば、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ）は、結合対の第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。所定の場合には、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォア、およびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0151] 所定の他の実施形態では、工程（ｃ）におけるアッセイは： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成する（例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる）ために前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成する（例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる）ために前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、 前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、 （ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。] [0152] 活性化状態非依存性抗体は、促進成分を用いて直接的に標識できる、または促進成分を用いて、例えば活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１メンバーを用いて直接的に標識することができる、またはシグナル増幅対の第１メンバーを用いて、例えば活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第１メンバーとシグナル増幅対の第１メンバーに結合された結合対の第２メンバーとの間の結合によって間接的に標識することができる。所定の場合には、結合対の第１メンバーはビオチンであり、結合対の第２メンバーは、例えばストレプトアビジンまたはニュートラビジンなどのアビジンである。] [0153] 一部の実施形態では、促進成分は、例えば、グルコースオキシダーゼであってもよい。所定の場合には、グルコースオキシダーゼおよび活性化状態非依存性抗体は、例えば実施例１６および１７に記載したように、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約５００ｋＤａ（例えば、約２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、または７５０ｋＤａ）の分子量を有する。他の実施形態では、酸化剤は、例えば過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）であってもよい。さらにまた別の実施形態では、シグナル増幅対の第１メンバーは、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などのペルオキシダーゼであってもよい。別の実施形態では、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォアおよび、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0154] 所定の場合には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよび活性化状態依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子に結合させることができる。スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、典型的には、約７０ｋＤａ（例えば、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｋＤａ）の分子量を有する。] [0155] 一部の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療へ被験者が応答する見込みの予測を補助または支援するために有用な可能性がある。他の実施形態では、本発明の方法は、抗癌剤を用いた治療へ被験者が応答する見込みの予測を改良するために有用な可能性がある。] [0156] また別の態様では、本発明は、固体支持体上に固定された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、各希釈系列中の前記捕捉抗体は細胞抽出物中のシグナル伝達経路の成分または他のタンパク質（例えば、核ホルモン受容体）の成分に対応する１つ以上の分析物に対して特異的であるアレイを提供する。] [0157] 所定の実施形態では、シグナル伝達経路は、細胞増殖に関係する可能性がある。そのような実施形態では、捕捉抗体は、例えば、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、およびＡＩＢ１と反応性である抗体からなる群より選択される１つ以上のメンバーを含むことができる。所定の他の実施形態では、シグナル伝達経路は、腫瘍血管新生に関係する可能性がある。そのような実施形態では、捕捉抗体は、例えば、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２、Ｖ−カドヘリン−Ｒ２複合体、ＰＤＧＦＲＡ、およびＰＤＧＦＲＢと反応性である抗体からなる群より選択される１つ以上のメンバーを含むことができる。したがって、本明細書に記載したアドレス可能なアレイは、乳癌に関係するシグナル伝達分子および他のタンパク質の発現および／または活性化状態を決定するために特に有用である。] [0158] 追加の態様では、本発明は、切断受容体の存在（または非存在）を検出するための方法であって： （ａ）細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｂ）前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する（例えば、細胞抽出物を特異的全長受容体または全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換させる）ために前記全長受容体を取り除く工程と； （ｃ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成する（例えば、全長受容体欠失細胞抽出物中に存在する切断受容体を切断受容体および捕捉抗体の複合体へ変換させる）ために固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する（例えば、捕捉された切断受容体の複合体を、捕捉された切断受容体および活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉された切断受容体の複合体に変換させる）ために、前記複数の捕捉された切断受容体を対応する切断受容体に対して特異的な検出抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｅ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｆ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。] [0159] 切断受容体は、典型的には全長受容体のフラグメントであり、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を全長受容体と共有する。所定の実施形態では、全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。何らかの特定の理論によって結び付けられなくても、切断受容体は、全長受容体のＥＣＤのタンパク質分解プロセッシングを通して、または例えば短縮ＥＣＤを備える切断受容体または膜関連もしくは細胞質ＩＣＤフラグメントを含む切断受容体を作成するために、膜貫通ドメイン前、内、または後に所在するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって発生する可能性がある。] [0160] 所定の好ましい実施形態では、切断受容体はｐ９５ＥｒｂＢ２であり、対応する全長受容体はＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）である。しかし当業者であれば、切断タンパク質を検出するための本明細書に記載した方法は、ＥＧＦＲＶ１１１変異体（膠芽細胞腫、結腸直腸癌などに関係すると見なされている）、または他の切断受容体であるチロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含むがそれらに限定されない多数の様々なタンパク質に適用できることを理解するであろう。実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット単一検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを使用して希少循環細胞中のｐ９５ＥｒｂＢ２などの切断受容体を検出するための、本発明のアッセイ方法の典型的な実施形態を提供している。] [0161] 一部の実施形態では、ＥＣＤ結合領域に対して特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、このときストレプトアビジンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している。所定の場合には、抗体は、全長受容体のＥＣＤ結合領域に対して特異的である。他の実施形態では、細胞抽出物は、例えば乳房腫瘍などの固形腫瘍の循環細胞を溶解させる工程によって生成される。循環細胞は、本明細書に記載した任意の技術、例えば免疫磁気分離法によってサンプルから単離することができる。適切なサンプルには、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、サンプルは、全血である。または、細胞抽出物は、例えば乳房腫瘍組織などの腫瘍組織から単離した細胞を溶解させる工程によって生成される。腫瘍組織は、例えば、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織であってもよい。１つの好ましい実施形態では、細胞は、細針吸引液（ＦＮＡ）サンプルとして腫瘍組織から単離される。] [0162] 一部の実施形態では、単離した細胞は、本明細書に記載したように成長因子を用いてインビトロで刺激される。他の実施形態では、単離した細胞は、成長因子刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる。適切な抗癌剤には、例えば、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン治療薬、放射線療法薬、およびワクチンなどの本明細書に記載した１つ以上の治療薬が含まれる。] [0163] 所定の実施形態では、複数の検出可能な捕捉された切断受容体の活性化状態が調べられる（interrogated）。調べる（interrogate）べき活性化状態は例えば、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。所定の他の実施形態では、複数の捕捉抗体が固定される固体支持体は、例えば、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、複数の捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される。] [0164] 一部の場合には、検出抗体は、結合対の第１メンバー（例えば、ビオチン）を含む。他の場合には、シグナル増幅対の第１メンバー（例えば、ＨＲＰなどのペルオキシダーゼ）は、結合対の第２メンバー（例えば、ストレプトアビジン）を含む。所定の場合には、シグナル増幅対の第２メンバーは、例えば、チラミド試薬（例えば、ビオチン−チラミド）であってもよい。好ましくは、増幅したシグナルは、活性化チラミドを生成する（例えば、ビオチン−チラミドを活性化チラミドに変換させる）ためにビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される。活性化チラミドは、直接的に検出できる、または例えばシグナル検出試薬の添加に基づいて間接的に検出できる。シグナル検出試薬の非限定的な例には、ストレプトアビジン標識フルオロフォア、およびストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼと例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの発色試薬との組み合わせが含まれる。] [0165] 関連態様では、本発明は、切断受容体の存在（または非存在）を検出するための方法であって： （ａ）細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｂ）前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する（例えば、細胞抽出物を特異的全長受容体または全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換させる）ために前記全長受容体を取り除く工程と； （ｃ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成する（例えば、全長受容体欠失細胞抽出物中に存在する切断受容体を切断受容体および捕捉抗体の複合体へ変換させる）ために固体支持体上に固定される工程と； （ｄ）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する（例えば、前記捕捉された切断受容体の複合体を、前記捕捉された切断受容体および検出抗体を含む検出可能な捕捉された切断受容体を含む複合体に変換させる）ために、前記複数の捕捉された切断受容体を、複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する切断受容体に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする（例えば、接触させる）工程であって、 前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、 （ｅ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を前記シグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする（例えば、接触させる）工程と； （ｆ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。] [0166] 切断受容体は、典型的には全長受容体のフラグメントであり、細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を全長受容体と共有する。所定の実施形態では、全長受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域を含む。何らかの特定の理論によって結び付けられなくても、切断受容体は、全長受容体のＥＣＤのタンパク質分解プロセッシングを通して、または例えば短縮ＥＣＤを備える切断受容体または膜関連もしくは細胞質ＩＣＤフラグメントを含む切断受容体を作成するために、膜貫通ドメイン前、内、または後に所在するメチオニン残基からの翻訳の選択的開始によって発生する可能性がある。] [0167] 所定の好ましい実施形態では、切断受容体はｐ９５ＥｒｂＢ２であり、対応する全長受容体はＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）である。しかし当業者であれば、切断タンパク質を検出するための本明細書に記載した方法は、ＥＧＦＲＶ１１１変異体（膠芽細胞腫、結腸直腸癌などに関係すると見なされている）、または他の切断受容体であるチロシンキナーゼ、カスパーゼなどを含むがそれらに限定されない多数の様々なタンパク質に適用できることを理解するであろう。実施例１２は、優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット近接二重検出マイクロアレイＥＬＩＳＡを使用して希少循環細胞中のｐ９５ＥｒｂＢ２などの切断受容体を検出するための、本発明のアッセイ方法の典型的な実施形態を提供している。] [0168] 一部の実施形態では、ＥＣＤ結合領域に対して特異的な複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、このときストレプトアビジンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している。所定の場合には、抗体は、全長受容体のＥＣＤ結合領域に対して特異的である。他の実施形態では、細胞抽出物は、例えば乳房腫瘍などの固形腫瘍の循環細胞を溶解させる工程によって生成される。循環細胞は、本明細書に記載した任意の技術、例えば免疫磁気分離法によってサンプルから単離することができる。適切なサンプルには、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。１つの好ましい実施形態では、サンプルは、全血である。または、細胞抽出物は、例えば乳房腫瘍組織などの腫瘍組織から単離した細胞を溶解させる工程によって生成される。腫瘍組織は、例えば、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織であってもよい。１つの好ましい実施形態では、細胞は、細針吸引液（ＦＮＡ）サンプルとして腫瘍組織から単離される。] [0169] 一部の実施形態では、単離した細胞は、本明細書に記載したように成長因子を用いてインビトロで刺激される。他の実施形態では、単離した細胞は、成長因子刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる。適切な抗癌剤には、例えば、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン治療薬、放射線療法薬、およびワクチンなどの本明細書に記載した１つ以上の治療薬が含まれる。] [0170] 所定の実施形態では、複数の検出可能な捕捉された切断受容体の活性化状態が調べられる（interrogated）。調べる（interrogate）べき活性化状態は例えば、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、またはそれらの組み合わせであってもよい。所定の他の実施形態では、複数の捕捉抗体が固定される固体支持体は、例えば、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態では、複数の捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される。] [0171] 活性化状態非依存性抗体は、促進成分を用いて直接的に標識できる、または前記促進成分を用いて、例えば活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって間接的に標識することができる。同様に、活性化状態依存性抗体は、シグナル増幅対の第１メンバーを用いて直接的に標識することができる、または前記シグナル増幅対の第１メンバーを用いて、例えば活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第１メンバーとシグナル増幅対の第１メンバーに結合された結合対の第２メンバーとの間の結合によって間接的に標識することができる。所定の場合には、結合対の第１メンバーはビオチンであり、結合対の第２メンバーは、例えばストレプトアビジンまたはニュートラビジンなどのアビジンである。]
权利要求: 請求項1 乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法であって：（ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と；（ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と；（ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と；（ｄ）前記抗癌剤が、前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法。 請求項2 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項１に記載の方法。 請求項3 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項２に記載の方法。 請求項4 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項２に記載の方法。 請求項5 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項１に記載の方法。 請求項6 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項５に記載の方法。 請求項7 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。 請求項8 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。 請求項9 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項１に記載の方法。 請求項10 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項９に記載の方法。 請求項11 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項９に記載の方法。 請求項12 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で刺激される、請求項１に記載の方法。 請求項13 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 請求項14 前記モノクローナル抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ゲムツズマブ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商品名））、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 請求項15 前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、カネルチニブ（ＣＩ１０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６）、イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ（商品名）；ＺＤ６４７４）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 請求項16 前記化学療法薬は、ペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、シロリムス（ラパマイシン）、ラパマイシンアナログ、白金化合物、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 請求項17 前記ホルモン療法薬は、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体調節剤、ステロイド、フィナステリド、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 請求項18 前記放射線療法薬は、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。 請求項19 前記１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項１に記載の方法。 請求項20 前記複数のシグナル伝達分子は、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。 請求項21 前記複数のシグナル伝達分子は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ−２（ＥｒｂＢ２）、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ−３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ−４（ＥｒｂＢ４）、Ｒａｆ、ＳＲＣ、Ｍｅｋ、ＮＦｋＢ−ＩｋＢ、ｍＴｏｒ、ＰＩ３Ｋ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、Ｅｐｈ−ａ、Ｅｐｈ−ｂ、Ｅｐｈ−ｃ、Ｅｐｈ−ｄ、ｃＭｅｔ、ＦＧＦＲ、ｃＫｉｔ、Ｆｌｔ−３、Ｔｉｅ−１、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｔ−３、ｃＦＭＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、Ａｂｌ、ＦＴＬ３、ＲＥＴ、Ｋｉｔ、ＨＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、ＡＩＢ１、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。 請求項22 前記複数のシグナル伝達分子は、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＥＲ、ＰＲ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。 請求項23 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 請求項24 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 請求項25 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項１に記載の方法。 請求項26 前記アッセイは、工程（ｃ）において： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と；（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項１に記載の方法。 請求項27 前記活性化状態依存性抗体は、結合対の第１メンバーを含む、請求項２６に記載の方法。 請求項28 前記結合対の第１メンバーは、ビオチンである、請求項２７に記載の方法。 請求項29 前記シグナル増幅対の第１メンバーは、前記結合対の第２メンバーを含む、請求項２６に記載の方法。 請求項30 前記結合対の第２メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項２９に記載の方法。 請求項31 前記シグナル増幅対の第１メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項２９に記載の方法。 請求項32 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項３１に記載の方法。 請求項33 前記シグナル増幅対の第２メンバーは、チラミド試薬である、請求項３１に記載の方法。 請求項34 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項３３に記載の方法。 請求項35 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項３４に記載の方法。 請求項36 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項３５に記載の方法。 請求項37 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項３５に記載の方法。 請求項38 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項３７に記載の方法。 請求項39 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項３７に記載の方法。 請求項40 前記発色試薬は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項３９に記載の方法。 請求項41 前記アッセイは、工程（ｃ）において： （ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項１に記載の方法。 請求項42 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて直接的に標識される、請求項４１に記載の方法。 請求項43 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて、活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって標識される、請求項４１に記載の方法。 請求項44 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第１メンバーを用いて直接的に標識される、請求項４１に記載の方法。 請求項45 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第１メンバーを用いて、前記活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第１メンバーと前記シグナル増幅対の第１メンバーに結合された前記結合対の第２メンバーとの間の結合によって標識される、請求項４１に記載の方法。 請求項46 前記結合対の第１メンバーは、ビオチンである、請求項４５に記載の方法。 請求項47 前記結合対の第２メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項４５に記載の方法。 請求項48 前記促進成分は、グルコースオキシダーゼである、請求項４１に記載の方法。 請求項49 前記グルコースオキシダーゼおよび前記活性化状態非依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子へ結合される、請求項４８に記載の方法。 請求項50 前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、５００ｋＤａの分子量を有する、請求項４９に記載の方法。 請求項51 前記酸化剤は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項４８に記載の方法。 請求項52 前記シグナル増幅対の第１メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項５１に記載の方法。 請求項53 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項５２に記載の方法。 請求項54 前記シグナル増幅対の第２メンバーは、チラミド試薬である、請求項５２に記載の方法。 請求項55 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項５４に記載の方法。 請求項56 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項５５に記載の方法。 請求項57 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項５６に記載の方法。 請求項58 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項５６に記載の方法。 請求項59 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項５８に記載の方法。 請求項60 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項５８に記載の方法。 請求項61 前記発色試薬は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項６０に記載の方法。 請求項62 抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法であって：（ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と；（ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と；（ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と；（ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法。 請求項63 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項６２に記載の方法。 請求項64 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項６３に記載の方法。 請求項65 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項６３に記載の方法。 請求項66 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項６２に記載の方法。 請求項67 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項６６に記載の方法。 請求項68 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。 請求項69 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６６に記載の方法。 請求項70 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項６２に記載の方法。 請求項71 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項７０に記載の方法。 請求項72 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項７０に記載の方法。 請求項73 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項６２に記載の方法。 請求項74 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。 請求項75 前記１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項６２に記載の方法。 請求項76 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。 請求項77 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６２に記載の方法。 請求項78 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項６２に記載の方法。 請求項79 前記アッセイは、工程（ｃ）において：（ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と；（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項６２に記載の方法。 請求項80 前記アッセイは、工程（ｃ）において：（ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項６２に記載の方法。 請求項81 抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍を有する被験者の応答を予測するための方法であって：（ａ）抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と；（ｂ）細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と；（ｃ）前記細胞抽出物中の１つ以上の分析物の活性化状態を、前記１つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と；（ｄ）前記１つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法。 請求項82 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項８１に記載の方法。 請求項83 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項８２に記載の方法。 請求項84 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項８２に記載の方法。 請求項85 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項８１に記載の方法。 請求項86 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項８５に記載の方法。 請求項87 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８６に記載の方法。 請求項88 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。 請求項89 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項８１に記載の方法。 請求項90 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項８９に記載の方法。 請求項91 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項８９に記載の方法。 請求項92 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項８１に記載の方法。 請求項93 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。 請求項94 前記１つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項８１に記載の方法。 請求項95 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。 請求項96 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項８１に記載の方法。 請求項97 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項８１に記載の方法。 請求項98 前記アッセイは、工程（ｃ）において：（ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と；（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項８１に記載の方法。 請求項99 前記アッセイは、工程（ｃ）において：（ｉ）複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と；（ｉｉ）複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第１メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第１メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、（ｉｉｉ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項８１に記載の方法。 請求項100 固体支持体上に固定された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、各希釈系列中の捕捉抗体は細胞抽出物中のシグナル伝達経路の成分に対応する１つ以上の分析物に対して特異的である、アレイ。 請求項101 前記シグナル伝達経路は、細胞増殖に関係している、請求項１００に記載のアレイ。 請求項102 前記捕捉抗体は、ＩＧＦ１Ｒ、ｃＭＥＴ、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＥＲ、ＰＲ、ＮＣＯＲ、およびＡＩＢ１と反応性である抗体からなる群より選択される１つ以上のメンバーを含む、請求項１０１に記載のアレイ。 請求項103 前記シグナル伝達経路は、腫瘍血管新生に関係している、請求項１００に記載のアレイ。 請求項104 前記捕捉抗体は、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ、Ｒｓｋ、Ａｋｔ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、Ｔｉｅ２、Ｖ−カドヘリン−Ｒ２複合体、ＰＤＧＦＲＡ、およびＰＤＧＦＲＢと反応性である抗体からなる群より選択される１つ以上のメンバーを含む、請求項１０３に記載のアレイ。 請求項105 切断受容体の存在を検出するための方法であって：（ａ）細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と；（ｂ）前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と；（ｃ）前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は前記切断受容体の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と；（ｄ）複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を前記対応する切断受容体に対して特異的である検出抗体とインキュベートする工程と；（ｅ）増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第１および第２メンバーとインキュベートする工程と；（ｆ）前記シグナル増幅対の第１および第２メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法。 請求項106 前記切断受容体は、ｐ９５ＥｒｂＢ２である、請求項１０５に記載の方法。 請求項107 前記全長受容体は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ−２）である、請求項１０５に記載の方法。 請求項108 細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に対して特異的な前記複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、前記ストレプトアビジンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している、請求項１０５に記載の方法。 請求項109 前記抗体は、前記全長受容体の前記ＥＣＤ結合領域に対して特異的である、請求項１０８に記載の方法。 請求項110 前記細胞抽出物は、乳房腫瘍の循環細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項１０５に記載の方法。 請求項111 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項１１０に記載の方法。 請求項112 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１１に記載の方法。 請求項113 前記細胞抽出物は、腫瘍組織から単離した細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項１０５に記載の方法。 請求項114 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項１１３に記載の方法。 請求項115 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項１１３に記載の方法。 請求項116 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項１１１または１１３に記載の方法。 請求項117 前記単離した細胞は、成長因子刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、請求項１１６に記載の方法。 請求項118 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１７に記載の方法。 請求項119 前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体の活性化状態が調べられる（interrogated）、請求項１０５に記載の方法。 請求項120 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１９に記載の方法。 請求項121 前記検出抗体は、結合対の第１メンバーを含む、請求項１０５に記載の方法。 請求項122 前記結合対の第１メンバーは、ビオチンである、請求項１２１に記載の方法。 請求項123 |